Arrivée d’un microscope à super-résolution de type STED à la Plateforme de Cytologie/Imagerie de l’Observatoire du Végétal

La microscopie de fluorescence reste incapable de résoudre deux points distants de moins de 250 à 300 nm. Le microscope STED permet de dépasser la limite de résolution et donc d’offrir de nouvelles approches pour les équipes positionnées sur les fronts de science actuels, en particulier pour une imagerie sub-cellulaire fine (nanostructures de la paroi, vésicules intracellulaires, filaments d’actine, microtubules, larges complexes protéiques, chromosomes, interactions protéiques, influence du microenvironnement, détection de sondes multiples, etc), ainsi que pour les reconstructions 3D et la modélisation.

La plateforme "Cytologie/Imagerie" PO-Cyto de l’Observatoire du Végétal OV accueille un tout nouveau microscope (Leica Stellaris 8) permettant l’imagerie à super-résolution de type STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy) et l’imagerie FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). Ce microscope a été obtenu grâce à plusieurs financements (Sesame, SPS, CNOC, IBISA, INRAE). Il permet de faire des observations en mode confocal classique, mais également en mode STED, d’échantillons vivants ou fixés, tels que des tissus, des cellules, des compartiments sub-cellulaires. Le mode STED permet une résolution en 3D des objets analysés supérieure à la limite de séparation et donc de mieux appréhender l’organisation de nanostructures jusqu’alors impossibles à détecter en microscopie classique. Par ailleurs, le microscope possède un module FLIM qui permet d’utiliser l’analyse du temps de vie de fluorescence à haute vitesse. Ce dispositif va donc permettre de développer de nouveaux axes de recherche et d’explorer l’imagerie fonctionnelle telle que les interactions moléculaires et l’influence du microenvironnement.

Le STED est une technique de microscopie de fluorescence à balayage qui utilise une émission stimulée/déplétée (en donut) pour éliminer la fluorescence des régions extérieures de la réponse impulsionnelle optique d'excitation. La largeur de la zone centrale du donut pouvant encore émettre de la lumière est ajustée grâce à la saturation de la fluorescence. Cette technique de nanoscopie permet d’obtenir une résolution proche de 50 nm en XY et de 100 nm en Z avec l’option STED 3D, sur une gamme spectrale allant de 440 à 790 nm. Le système possède une conception exclusive de l’excitation et de la détection spectrale à haute sensibilité basée sur un prisme avec des bandes de détections librement ajustables pour l’ensemble des canaux de fluorescence. L’équipement possède par ailleurs un laser pulsé blanc (440 à 700nm) qui, associé à des détecteurs sensible pouvant fonctionner en mode comptage de photons, autorise la technique FLIM qui consiste à quantifier les temps de vie de fluorescence d’un fluorophore pour chaque pixel de l’image.Ce nouveau système permet de travailler à très haute vitesse et donc d’étudier les interactions rapides entre protéines (FRET-FLIM), ou protéine-ligand, ou protéines dans leur micro-environnement (biosenseurs).

Ce dispositif est le troisième installé en France et est ouvert à toute la communauté scientifique. Il va permettre de former de nouveaux chercheurs à des thématiques émergentes d’une part et, d’autre part, de développer de nouvelles thématiques pour explorer les nanostructures et leurs fonctions. Ces approches sont indispensables pour une meilleure compréhension de mécanismes biologiques complexes et proposer, ou alimenter, des modèles.

En relation avec une recherche développée à l’Institut Jean-Pierre Bourgin - Sciences du Végétal.