Soutenance de thèse : Florent Fontaine

Étude fonctionnelle des domaines d'adressage aux Gouttelettes Lipidiques (GL) pour améliorer la purification de protéines recombinantes

La production de protéines recombinantes hydrophobes, comme les protéines transmembranaires, reste un défi en raison de leur association avec un environnement lipidique, rendant la purification complexe et coûteuse (jusqu'à 80 % des coûts de production). Une approche innovante a été proposée dans cette thèse : utiliser les propriétés hydrophobes de la gouttelette lipidique (GL) végétale pour permettre le repliement et la purification par flottaison de protéines membranaires, grâce à un ancrage via l'oléosine, protéine majeure des GLs de graines. Bien que cette technique soit validée pour des protéines solubles, comme l'insuline, elle n’a pas encore été appliquée aux protéines transmembranaires. Les GLs sont des structures dynamiques formées d'un cœur de lipides neutres, tels que les triacylglycérols (TAGs), entouré d'une monocouche de phospholipides à laquelle des protéines peuvent être associées, provenant principalement du RE ou du cytosol. Certaines de ces protéines, impliquées dans la biogenèse des GLs, s’attachent précocement à leur surface. Bien que les protéines ne possèdent pas de domaine conservé pour leur adressage aux GLs, leur localisation dépend souvent de motifs structurels spécifiques. Cependant, ces motifs peuvent également être présents sur des protéines non associées aux GLs, ce qui complique l’étude de leur spécificité et souligne la nécessité d’approfondir ce domaine de recherche. Cette thèse contribue à élucider les mécanismes qui régissent les interactions entre les protéines et les GLs, en mettant l’accent sur les facteurs influençant leur spécificité et leur affinité pour la surface des GLs, l'objectif étant d'identifier des leviers potentiels pour des applications biotechnologiques. Dans cette étude, j’ai pu démontrer que les GLs peuvent être exploitées pour la purification de protéines hydrophobes fusionnées à AtOLE1, l’oléosine majeure des graines d’Arabidopsis thaliana, en utilisant les protéines E et M du SARS-CoV-2 comme preuve de concept. Pour cela, dans un premier temps, j’ai utilisé Nicotiana benthamiana sur-produisant transitoirement des GLs et de la microscopie afin d’évaluer si E et M se retrouvaient au niveau des GLs grâce à AtOLE1. De plus, j’ai développé un pipeline de colocalisation qui m’a permis de quantifier cette spécificité, c'est-à-dire leur capacité à cibler exclusivement les GLs, et ainsi montrer que AtOLE1 permettait bien d’adresser E aux GLs. Dans un second temps, E et M ont été exprimées dans les graines de Camelina sativa. Une fois les GLs purifiées, il a été possible de détecter E et M à la surface des GLs, et que cet adressage était amélioré grâce à une fusion avec OLE1.

Ce travail a ainsi montré que l'efficacité de l'adressage aux GLs varie selon le châssis végétal utilisé, ce qui révèle que ces mécanismes sont encore mal compris. Afin d’améliorer les connaissances sur les mécanismes d'interaction entre protéines et GLs, j’ai évalué la spécificité d’interaction protéine/GL d’une collection de protéines et domaines par microscopie en utilisant le même procédé que j’ai mis en place pour les protéines membranaires dans N. benthamiana. De plus, cette spécificité a été comparée aux propriétés structurales des protéines, telles que la charge et l'hydrophobicité. Contre toute attente, aucune corrélation n’a été trouvée entre ces propriétés structurales et la spécificité pour les GLs. En revanche, il semble que cette spécificité soit davantage influencée par la fonction des protéines dans la biogenèse des GLs ou par leur cinétique d’arrivée. En effet, les protéines qui se localisent très tôt à la surface de la monocouche présentent une spécificité accrue. En revanche, l’affinité des protéines aux GLs, c’est-à-dire la capacité de rester associée aux GLs, n’a pu être quantifiée dans ce châssis, la surproduction transitoire de GLs n’étant pas suffisante pour cela. Un nouveau châssis, un N. benthamiana suraccumulant de façon stable des GLs, a donc dû être produit. Comparé au WT, ce châssis présente de 22 à 23 fois plus de GLs. Après isolement, ces GLs ont été soumises à divers lavages, avec des conditions de plus en plus stringentes, et les protéines associées ont été détectées par des techniques de biochimie. Cette technique d’évaluation d’affinité, initialement basée sur la graine, a été pour la première fois utilisée dans un contexte de feuille. Les résultats obtenus pour trois protéines ont montré que les protéines se trouvaient sous forme d’oligomères sur les GLs et qu'elles restaient accrochées quelque soit la stringence du traitement. Les résultats obtenus précédemment ont été validés dans des graines de C. sativa, en traçant la production d’une protéine commerciale d’un facteur de croissance, HsFGF2. Ces observations mettent en évidence que la cinétique d’arrivée et le rôle fonctionnel des protéines dans la biogenèse des GLs sont des facteurs déterminants pour leur spécificité et leur affinité dans l’adressage aux GLs. Ces connaissances contribueront à optimiser l’utilisation des GLs et des protéines qui leur sont associées pour des applications biotechnologiques.

Directeur de thèse : Jean-Denis Faure - INRAE, IJPB, Versailles, équipe "Dynamique et Ingénierie des Compartiments Lipidiques" DECLIC
Co-Directeur de thèse : Chouaïb Meziadi, Core Biogenesis, Strasbourg
Co-encadrante de thèse : Marine Froissard - INRAE, IJPB, Versailles, équipe "Dynamique et Ingénierie des Compartiments Lipidiques" DECLIC

Composition du jury
> Juliette Salvaing (Rapportrice) - INRAE, Irig, Grenoble
> Alenka Čopič (Rapportrice) - CNRS, CRBM,Montpellier
> Christelle Lopez (Examinatrice) - INRAE, BIA, Nantes
> Michel Hernould (Examinateur) - Université Bordeaux, BFP, Villenave d'Ornon




Florent Fontaine prête le serment des doctorants.




Une recherche développée à l’Institut Jean-Pierre Bourgin - Sciences du Végétal.